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熒光定量PCR服務 生信分析 技術參數 常見問題 留言咨詢

       熒光定量PCR技術產生并成熟于上世紀90年代,由于該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍,能夠對PCR反應的全過程進行實時監控,并且自動化程度高,所以該技術從產生到現在短短的十幾年時間,在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用,成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。

熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析。


技術應用

       分析點突變和等位基因;

       基因表達的定量分析;

       DNA甲基化檢測;

       單核苷酸多態性分析;

       定量定性分析傳染病疾病。

 

美吉優勢

       采用ABI7500熒光定量PCR儀,提供可靠的數據;

       專業的技術支持,從實驗設計開始就能為您提供幫助;

       完整的實驗報告,讓您輕松分析實驗結果;

       多臺ABI7500,能夠縮短實驗周期,讓您更快的得到實驗結果。




技術路線

1、如果您寄送的是環境樣本、污泥、土壤或者您抽提的是RNA樣本,請以干冰的形式進行運輸,以保證存放的溫度接近于-80℃;

2、如提供實驗材料為動物組織材料,樣品質量需大于 2g;
     如提供實驗材料為植物樣品,樣品質量需大于4g;
     如提供實驗材料為培養細胞,請你提供個數大于1×107培養好的細胞;
     如提供實驗材料為血液樣品,請你提供≥2ml的樣品。

3、請務必標注好您所要做的基因的名稱、序列以及擴增產物的片段大小;


1.熒光定量的實驗周期是多長?

       QPCR的實驗周期一般是15-20工作日。具體實驗周期視樣本數量及檢測基因個數而定。


2.PCR和QPCR有什么區別?
       ① 熒光定量 PCR (QPCR)能夠實時監測 PCR 反應的全過程,對每一個循環進行定量定性分析;而普通 PCR 只能對反應的終產物進行半定量定性分析。
       ② QPCR 的結果分析可以直接通過電腦讀出,而普通 PCR 的結果必須通過下一步的電泳條帶分析。


3.絕對定量和相對定量有什么區別?

       熒光定量有兩種定量類型,分別為絕對定量和相對定量。這兩種定量方法的不同點在于:

?       目的不同:絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數;相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數;

      實驗方法不同:絕對定量必須使用已知拷貝數的標準品,必須做標準曲線;而相對定量可以做標準曲線,也可以不做標準曲線,僅利用Ct值的不同來分析實驗結果。


4.絕對定量和相對定量的選擇?

       絕對定量的標準曲線法和相對定量的比較Ct法是我們最擅長的兩種實驗方案。不論哪種方案,我們均采用染料法(即SYBR Green I)作為檢測方法。

       標準曲線法,將標準品稀釋至不同濃度,作為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標,以測得的CT值為縱坐標,繪制標準曲線,對未知樣品進行定量時,根據未知樣品的CT值,即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數。
       比較Ct法,也就是2^(-△△CT)法。其中△△CT=(待測組目的基因Ct值-待測組內參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值),因此,2^(-△△CT)表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的而變化倍數,使用這一方法可以直接得到目的基因相對于內參基因的量。比較CT法的優點是不需構建標準品,節省時間、試劑,缺點是必須確定待測基因和看家基因的的擴增效率,效率接近時結果才可靠,否則結果不能用。 


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