美吉生物

蛋白質組學和代謝組學 定量蛋白質組學 蛋白質絕對定量PRM

產品簡介 產品互動

    由于同一個樣本中的不同蛋白和肽段離子化效率不同,絕對定量的信息獲取具有很大挑戰。多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)技術是一種基于已知或假定的反應離子信息,有針對性地選擇數據進行質譜信號采集,對符合規則的離子進行信號記錄,去除不符合規則離子信號的干擾,通過對數據的統計分析從而獲取質譜定量信息的質譜技術。利用質譜多反應監測技術與同位素稀釋相結合,通過對比已知濃度的標記標準品與待測樣品目標離子峰面積信息,從而推算分析物含量。


    平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring,PRM)屬于靶向MS/MS分析,在整個液相分離過程中會不斷地對每一個目標母離子的全部碎片離子圖譜進行記錄。相比于傳統SRM只檢測目標離子對的模式,PRM檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片信息。在文獻中,在Q Exactive質譜上進行的該分析模式被稱為PRM,而在LTQ線性離子阱或LTQ-Orbitrap質譜上則被稱為SRM。相比而言,四極桿的優勢在于離子分離速度和效率更高,以及能夠使用多重單離子監視(SIM),而且制造成本更低。PRM主要的優勢就是使用了超高分辨率的Orbitrap質量分析器,其能夠將干擾信息與真實的信號進行區分,以及相比于傳統的SRM方法能夠更好的保證分析的選擇性。其缺點是能夠監視的母離子的數量取決于Orbitrap分析器的工作循環或瞬時長度以及色譜條件。雖然,其數量能夠通過利用time-scheduling、parallelization和降低Orbitrap的分辨率來增加。PRM方法曾被用于定量酵母細胞裂解液中的10個聚泛素肽鏈。與早期的研究結果一致,該方法的動態范圍至少有3個數量級,其定量誤差<10%。而且無論是分選寬度還是基質干擾都不會改變其定量準確性。最低檢測限低于0.1 amol。數據處理可采用Skyline分析。


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實驗流程

應用領域

       標志物的驗證和絕對定量研究

       翻譯后修飾等缺乏抗體的特殊蛋白質和肽段的驗證和絕對定量研究

       基因突變、可變剪切、基因表達多態性在蛋白質表達方面的確證和定量

       極低豐度蛋白質的靶向檢測


技術優勢

      靈敏度高

      重現性好

      準確度高

      通量高


送樣要求


樣品類型

樣品要求(/組樣品)

備注

蛋白質溶液

蛋白質總量≥300μg

重復實驗則量翻倍,建議準備兩份樣品備用。

組織樣品

樣品總量≥0.1g

按照蛋白質組織提取效率(蛋白:組織=7%)

細胞樣品

細胞數量≥107個

胰酶消化,按細胞凍存標準離心收集細胞即可。

體液樣品

血清≥200μL,腦脊液≥200μL,尿液≥1mL ,淚液≥1mL.

 


案例:篩選乳腺癌轉移的生物標記物

    結合shotgun技術與靶向性的MRM技術,篩選可以作為乳腺癌生物標記物或者治療靶標的乳腺癌轉移相關蛋白質。利用label free N-糖基化蛋白質定量技術,鑒定到778個蛋白質的1515個糖基化肽段。結合MRM技術,發現10個蛋白質的在轉移的乳腺癌組織中異常表達。最后驗證發現5個潛在的乳腺癌轉移的生物標記物。


 



參考文獻:

  Sjostrom, M., et al. (2015) A Combined Shotgun and Targeted Mass Spectrometry Strategy for Breast Cancer Biomarker Discovery. Journal of proteome research 14, 2807-2818.

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