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蛋白質組學和代謝組學 定量蛋白質組學 iTRAQ/TMT

iTRAQ/TMT 生信分析 技術參數 案例解讀 常見問題 留言咨詢

         同重同位素標記的相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitationiTRAQ)技術由AB SCIEX2004年研發推出,是目前差異蛋白質定量分析方法通量最高,系統誤差最小,功能最強大的分析方法之一。iTRAQ試劑用于標記酶解后的肽段。在質譜圖中,任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵發生斷裂,質量平衡基團丟失,帶不同同位素標簽的同一多肽產生不同的報告離子,根據報告離子的信號強度值可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。 目前iTRAQ可同時比較多達8組樣品的蛋白質表達差異。而由Thermo Fisher 推出的同款原理相同的產品TMT(Tandem Mass Tag最多可同時標記分析10個樣品


iTRAQ試劑結構


iTRAQ實驗原理圖

實驗流程

技術平臺

    Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion? Tribrid?

技術優勢

     體外標記技術,適用于各種生物材料;

     靈敏度高,檢測限低,可檢測出低豐度蛋白;   

     分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質進行分離鑒定,包括高分子量蛋白質、酸性蛋白

     和堿性蛋白。  

     高通量:同時對8個樣本進行分析,提高了實驗通量,可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質進行分析;  

     結果可靠:定性與定量分析結果更加可靠;   

     自動化程度高:液相與質譜連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。

應用領域

      機理和調控機制研究

      動態過程中機制研究

      疾病標志物的篩選

      用藥及預后標志物篩選

 



生信分析

  






送樣要求

樣品類型

樣品要求(/組樣品)

備注

蛋白質溶液

蛋白質總量≥300μg

重復實驗則量翻倍,建議準備兩份樣品備用。

組織樣品

樣品總量≥0.1g

按照蛋白質組織提取效率(蛋白:組織=7%

細胞樣品

細胞數量≥107

胰酶消化,按細胞凍存標準離心收集細胞即可。

體液樣品

血清≥200μL,腦脊液≥200μL,尿液≥1mL ,淚液≥1mL.

 


案例:精神錯亂患者的患者的腦脊液中的蛋白質表達含量變化

          利用iTRAQ蛋白質組學相對定量方法,探討精神錯亂的發病機制通過iTRAQ方法分析17類精神錯亂患者的腦脊液中的蛋白質表達含量變化,一共鑒定并定量到了270個腦脊液中蛋白質:16個在大多數精神錯亂患者中異常表達;一部分蛋白質與認知程度和精神錯亂嚴重程度相關;這些結果為后期精神錯亂的機制研究及診斷提供了參考。


參考文獻:

        Poljak, A., et al. (2014) Quantitative proteomics of delirium cerebrospinal fluid. Translational psychiatry 4, e477.

1、iTRAQ定量蛋白質組實驗完成后,能拿到什么結果,是否可以直接用來發文章?

      我們目前的iTRAQ定量蛋白質組的實驗流程和結果都是受到業內頂級雜志JPR和MCP認可的,可以直接用于文章的發表。客戶不僅可以拿到iTRAQ定量蛋白質組中的差異蛋白、蛋白的GO和KEGG歸類信息、COG歸類、不同樣本的差異蛋白的聚類分析、差異蛋白的互作蛋白信息等,還可以提供客戶指定的分析內容,提供個性化的服務要求,比如轉錄組和蛋白質組的關聯分析。


2、iTRAQ技術有什么優勢?有什么缺陷?
        該技術的優勢:多達8標記、系統誤差小、直接對二級譜定量、定量蛋白數量更多、標記效率高等。

        該技術的缺陷:應該說這是唯一的缺陷,就是定量不是當前定量技術最準確的,最準確的是SWATH和MRM技術。定量不準確的原因是附近m/z同位素的干擾,這些m/z接近的同位素引入了干擾的4標記或8標記的同位素,最終導致原本差異10倍,而干擾會將10倍變成5倍左右。當然,差異蛋白的趨勢是正確的,大量發表的研究論文也證實了這一點。


3、目前貴公司iTRAQ技術采用什么型號的質譜儀?數據分析使用什么軟件?
       目前是我們使用的儀器包括AB Sciex公司的Triple TOF 5600,分析軟件為配套的proteinpilot;Thermo Fisher 的Q-Exactive, Orbitrap Fusion? Tribrid?,分析軟件為ProteomeDiscoverer。


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