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基因表達調控 轉錄組 真核有參轉錄組

真核有參轉錄組 生信分析 技術參數 案例解讀 常見問題 留言咨詢

? ? ? ?有參考基因組的轉錄組研究,推薦選用Illumina測序平臺,測得數據經過質控后mapping至參考基因組;對mapping到基因上的reads進行計數,計算基因的表達量后,進行基因表達差異及差異基因功能富集等分析。另外依據參考基因組,可進行諸如基因覆蓋度、測序飽和度等驗證性分析;可變剪切分析以及聯合miRNA數據進行關聯分析等高級分析。針對人、小鼠等模式生物,還可以進行蛋白網絡構建等分析,深入研究基因功能,進一步揭示基因間互作網絡等信息,為研究網絡調控機理提供方向。


美吉優勢

? ? ? ?美吉生物為您提供全面的轉錄組學研究方案。從樣本制備、建庫測序、生物信息學分析到后期數據解讀,通過一站式的專業服務,讓您更好地專注于科學研究。

? ? ? ?成熟、穩定的實驗流程保障實驗結果的可重復性;

? ? ? ?強大的超級計算平臺搭配經驗豐富的的生信分析專家團隊;

? ? ? ?從實驗方案設計到后期數據挖掘,全面助力您的科學研究。

技術路線




組織樣品

? ? ? ?1.動物組織:>2g

? ? ? ?2.植物組織:>4g

? ? ? ?3.細胞培養:>1*107

? ? ? ?4.血液樣品:≥2ml


RNA樣品

? ? ? ?1.請提供濃度≥50ng/μL,總量≥2μg的RNA(單次建庫用量為1μg),對于總量≥10ng的樣本可以采用微量建庫

? ? ? ?2.OD260/?280介于1.8 ~ 2.2之間,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,28S:18S≥1.0,確保RNA無降解

? ? ? ?3.送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封

? ? ? ?4.樣品保存期間切忌反復凍融

? ? ? ?5.送樣時請使用干冰運輸


cDNA樣品

? ? ? ?1.樣品需求量(單次):建議送樣量≥2μg,對于總量≥500ng的樣本可以采用風險建庫

? ? ? ?2.樣品濃度: 最低10ng/μL

? ? ? ?3.樣品純度:OD260/280介于1.80-2.00之間,RIN值≥6.5

? ? ? ?4.樣品保存期間切忌反復凍融,送樣時請使用干冰運輸


實驗周期

? ? ? ?1.樣品制備:5個工作日完成RNA抽提及質檢工作,將質檢報告發送給甲方,待甲方確認后開始正式實驗。(時間視具體樣品數量及特點而定)

? ? ? ?2. Illumina HiSeq測序:乙方在獲得甲方確認及收到預付款后25個工作日內完成測序工作。

? ? ? ?3.生物信息學分析:乙方在測序工作完成后25-35個工作日完成標準生物信息學分析。10-20個工作日完成高級生物信息學分析。(視具體工作量而定)

案例一

? ? ? ?油菜是世界三大植物油生產原料之一。油菜油脂主要儲存在種子中,其主要成分是甘油三脂(TAG)和脂肪酸(FA)。在種子發育過程中多種基因參與調控,其中轉錄因子扮演重要角色,其不僅參與調控種子和胚芽發育,而且參與能量儲備代謝,比如TAG合成和糖酵解途徑等。本研究通過RNA-seq方法,整體研究油菜發育過程中基因的表達調控機理。

研究結果

(1)轉錄組測序數據分析

? ? ? ?轉錄組測序獲得的reads總數為58,579,451條,每個發育階段約20 million reads。所有reads中有78.37%比對上基因組(unique比對率為88.66%,mult-match比對率為11.34%),基因長度分布在100-2000 bp范圍,約一半的基因長度在500-1500 bp之間。

?表1 ?油菜不同發育時期轉錄組測序數據統計

?表2 ?基因長度分布統計

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?(2)不同發育時期差異基因分析

? ? ? ?比較分析17 DAP (BnEF17) vs 35 DAP (BnEF35)、35 DAP (BnEF35) vs 52 DAP (BnEF52)差異基因,針對差異基因進行GO和KEGG富集分析,發現三個發育階段存在較大差異。

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圖1 ?油菜胚芽3個時期差異基因分析GO/KEGG注釋

(3)差異表達的轉錄因子編碼基因分析

? ? ? ?差異基因中有122個基因屬于編碼轉錄因子的基因,在油菜胚胎發育中分屬于27個轉錄因子家族。其中11個差異轉錄因子編碼基因參與種子發育和TAG合成途徑,其在發育時期的17和35 DAP表現為高表達而52 DAP表現為低表達。其中2個差異轉錄因子編碼基因在17 DAP高表達,而在35和52 DAP低表達。還有3個基因屬于鋅指蛋白家族,在17和52 DAP中低表達而在35 DAP中高表達。綜上說明,差異表達的轉錄因子基因在脂肪酸代謝中發揮復雜的調控作用。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?表3 ? 參與脂肪酸代謝的差異表達的轉錄因子編碼基因情況

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圖2 ? 油菜胚胎發育中差異表達的轉錄因子編碼基因分布

參考文獻

Deng W, Yan F, Zhang XL et al., Transcriptional profiling of canola developing embryo and identification of the important roles of BnDof5. 6 in embryo development and fatty acids synthesis [J]. Plant and Cell Physiology, 56(2015): 1625-1640.


案例二:

? ? ? ?組蛋白去甲基化酶LSD2同時具有E3泛素連接酶活性,LSD2能夠依賴其泛素連接酶活性促進O-GlcNAc糖基轉移酶降解,從而抑制OGT引起的腫瘤細胞生長。LSD2能夠直接對O-GlcNAc糖基轉移酶進行泛素化,抑制A549肺癌細胞系生長。另外通過基因工程手段敲除LSD2,能夠穩定OGT促進293T細胞的克隆形成。

重要結果

(1)利用免疫學實驗方法同時結合基因工程手段研究LSD2功能

? ? ? ?組蛋白去甲基化酶LSD2具有E3泛素連接酶活性,同時經證實該酶直接作用的底物為糖基轉移酶OGT。LSD2的E3泛素連接酶活性與它的組蛋白去甲基化酶是兩種獨立的酶活性。LSD2能夠通過泛素化OGT使其降解,當一種蛋白酶體抑制因子MG132存在時,LSD2調控OGT降解的作用也會被阻斷。

(2) LSD2抑制A549肺癌細胞的生長

? ? ? ?敲除LSD2基因后,293T-shLSD2細胞表現出腫瘤細胞成簇生長的特性 ,研究發現在癌細胞中LSD2的表達量低于293T細胞,尤其在A549肺癌細胞中的表達量最低。為了證實LSD2能夠抑制腫瘤細胞的生長,對A549-Mock細胞以及A549 EV, LSD2, LSD24CA細胞進行結晶紫染色以及細胞生長曲線實驗。結果表明A549-LSD2和A549-LSD24CA細胞克隆體數量明顯低于A549-EV和A549-Mock細胞。

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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖1 ? 敲除LSD2基因后促進293T細胞腫瘤發生(左圖)和各細胞系中LSD2基因的表達量(右圖)

(3)RNA-Seq技術發現LDS2可調控不同靶基因表達

? ? ? ?研究人員發現LSD2能夠通過其去甲基化酶活性和E3泛素連接酶功能調控不同靶基因表達。進一步對差異表達基因進行GO注釋發現,在A549-LSD24CA細胞中,LSD2可以參與steroid metabolic process(類固醇代謝), response to wounding(機體損傷應答), organ development(器官發育),cell growth(細胞生長),以及cell proliferation(細胞增殖)。而在細胞LSD2ER-AA中,LSD2則可以參與Wnt receptor signaling pathway(Wnt信號通路),stress reponse(應激反應),cell adhesion(細胞粘附)和immune response(免疫響應)。

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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 圖2 ? 差異表達基因聚類分析(左圖)和差異表達基因功能富集(右圖)

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參考文獻

Yi Yang, Xiaotong Yin, Huirong Yang,Yanhui Xu. Histone Demethylase LSD2 Acts as an E3 Ubiquitin Ligase and Inhibits Cancer Cell Growth through Promoting Proteasomal Degradation of OGT [J]. Molecular?Cell. 2015


1.如何確定研究物種有無參考基因組?

? ? ? ?根據所研究物種的拉丁文名,可在JGI(http://genome.jgi-psf.org/)、Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有該物種的基因組信息,也可在其他專門介紹某種物種的網站尋找參考基因組。?


2.是否一定要求設置生物學重復以及重復次數?

? ? ? ?目前沒有生物學重復的實驗發文章比較困難,尤其是IF≥5的雜志。文章投出之后,遭編輯質疑。如果確實受限于研究經費,無法設置生物學重復,那就得結合強有力的實驗數據做支撐,比如定量實驗、FISH熒光原位雜交或Northern blot等實驗數據說服編輯。重復設置原則上越多越好,但是考慮到現實條件,重復設置≥3。一般不建議設置兩個重復,因為如果兩者結果不一致,我們無法確定以哪個數據為參考。

注:3個生物學重復,不等同于將3個樣品的RNA等量混合后測序。3個樣品等量混合測序,相當于將3個樣本的基因表達量取平均值,其實就是相當于取了一個樣本,由此得到的差異基因同樣不可信,不能反應群體生物學現象。


3、真核核糖體RNA去除的話,去除率一般多高?和原核轉錄組去核糖體RNA的方法一樣嗎?

? ? ? ?和原核去除核糖體的原理是一致的,現在去除真核生物rRNA的kit也主要是Ribozero公司的,針對特異物種。根據長期項目經驗,絕大多數真核生物去除rRNA的效率大于90%。

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