美吉生物

    BSA（bulk segregant analysis）是近年來興起的一種快速簡單的性狀定位的方法，BSA性狀定位針對目標性狀，選擇表型極端差異的親本構建家系，對該家系目標性狀表型極端的子代分別混合得到的兩個樣本池進行全基因組重測序，檢測到的兩池間DNA差異片段即為候選區域，可進一步定位到目標性狀相關的基因或標記。利用該方法，可以快速的對單一性狀進行精細定位，加速目標性狀的功能基因組研究進程。

適用范圍

      （1）適用于有參考基因組的物種。

      （2）發生性狀分離的家系群體（F₂、BC、DH、RIL等）。特殊情況下可使用F1群體。

技術優勢

      （1）檢測范圍廣：能夠應對性狀定位中的多種情況（隱性突變、顯性突變、隱性致死突變等），適用于不同的性狀特點。

      （2）方法簡單：無需進行分子標記開發構建遺傳圖譜，有效縮短了育種時間，節約人力和物力。

      （3）量身定制分析策略：美吉生物針對性狀和群體特征靈活運用多種分析策略，針對性的解決性狀定位的種種問題。

      （4）周期短：僅僅45個工作日，即可完成一個性狀的定位分析。

技術流程

重測序建庫和測序流程

BSA生信分析流程

分析內容	解決問題	核心軟件
原始數據過濾	對原始數據質控，過濾低質量的序列	FastqQC／NGS-QC
參考基因組比對	將測序的reads比對到參考基因組	BWA/samtools
多態性檢測	統計目標樣本基因組多態性	Samtools/GATK/CNVanotor/BreakDancer
變異基因功能注釋	統計變異基因分布規律  尋找變異豐富的功能分類	Gene Annotation (In house)/Anovar/SnpEff
混池差異分析	找到與性狀相關的分子標記和基因	MutMap/QTL-seq/SHOREmap/NGM/Major-BSA(In house)

技術參數

性狀	樣品要求	測序策略	樣本混合策略	項目周期
數量性狀	OD260/OD280=1.8-2.0，濃度>25ng/ul，總量>2ug，DNA無降解，無污染。	親本≥10×；  子代池≥20×。	兩個極端性狀池，≥20個/池。	45個工作日出具結題報告。
質量性狀		親本≥10×；  子代池≥30×。	≥30個/池。

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案例一：通過QTL-seq檢測鷹嘴豆種子重量性狀的主效基因

    文章選擇兩個極端重量性狀親本進行雜交，采用單子傳代法構建RIL群體，子代種子重量性狀成正態分布排列（圖1a）。選取子代極端性狀個體構建兩個混合池并測序，根據Δ(SNP_index)方法將與種子重量相關的性狀位點定位在了1號染色體836,859-872,247 bp之間（圖1b），并用傳統QTL定位的方法驗證了該結果。對目標區域的基因功能和表達情況進行研究，發現CSN8是調控種子重量性狀的主效基因。

通過QTL-seq檢測鷹嘴豆種子重量性狀的主效基因

案例二： 用MutMap方法快速定位水稻鹽脅迫相關的質量性狀位點

    日本地震導致海嘯爆發、海水倒灌農田，使當地原本肥沃的土地變成了鹽堿地，水稻產量也受到影響，大幅下降。因此培育出耐鹽品種的水稻對日本農業生產具有重要意義。科學家采用EMS誘變的方法對當地水稻品種 "Hitomebore" 進行了處理，獲得了耐鹽型突變株。利用耐鹽型突變株和野生親本構建家系，F2代個體表型出現3:1的分離比，說明耐鹽性狀是單基因控制的質量性狀。選取帶有目標性狀的子代個體構建混合池并測序，將測序結果與野生親本基因組比對，得到SNP位點，通過Δ(SNP_index)的方法將目標性狀定位在6號染色體2.76-8.57Mb之間，在此區間篩選到與耐鹽性狀相關的基因（OsRR22）。該研究縮短了耐鹽品種水稻的育種進程，將對當地水稻產量恢復做出巨大貢獻。

水稻耐鹽突變基因定位

參考文獻

[1] Das S, Upadhyaya H D, Bajaj D, et al. Deploying QTL-seq for rapid delineation of a potential candidate gene underlying major trait-associated QTL in chickpea[J]. DNA Research, 2015: dsv004.

[2] Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(5): 445-449.