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項目文章2016-10-20 17:52

  內蒙古農業大學張和平教授團隊采用美吉生物Illumina Hiseq 2000測序平臺(相關測序工作由美吉生物協助完成)繪制了213株菌的基因組精細圖譜,結合比較基因組學和功能基因組分析方法,解析與菌株分化相伴隨的功能基因進化進程。研究成果"Expanding the biotechnology potential of lactobacilli through  comparative genomics of 213 strains and associated genera"發表在Nature子刊Nature Communications (IF:11.47)上。

技術:細菌基因組精細圖   

測序平臺:Illumina HiSeq2000

材料:乳酸桿菌

研究背景:

  乳桿菌屬(Lactobacillus)是乳酸菌最大的一個屬,在人和動物胃腸道微生態平衡有著重要的作用,也是乳制品發酵劑以及益生菌產品的主要菌株,乳酸桿菌屬已經確認的種和亞種已經超過200多。發酵食品的生產加工過程中經常有乳桿菌的參與,如白酒、谷物、果蔬、面包、肉以及乳制品等,同時也在人和動物的腸道中有著廣泛的分布。采用二代Illumina HeSeq 2000高通量測序平臺繪制其基因組圖譜,結合比較基因組和功能基因組分析方法,解析與菌株分化相伴隨的功能基因進化歷程,拓展其生物應用潛力。

主要研究結果:

1、屬的多樣性高于科的多樣性

  采用Illumina HiSeq2000 PE(2*100)進行測序,平均每個菌株得到190M的高質量數據。組裝最小基因組為1.23M,最大為4.91M。通過對213株研究發現共有44669個基因家族,對其中的73個核心基因進行ANI(平均核苷酸一致性)和TNI(總核苷酸一致性)的分析統計發現,Lactobacillus乳桿菌屬的基因組TNI值為13.97%。說明盡管乳桿菌歷來被定義為一個屬,但是遺傳多樣性遠高于其他典型的科水平的遺傳多樣性。



          Lactobacillus的ANI和TNI分布頻率與傳統的菌種分類比較

2、構建系統發育樹

  選擇來自26個門452個屬的菌株和Lactobacillus屬模式菌株,以它們同有的16個基因的氨基酸序列構建系統發育樹,結果顯示,Pediococcus、Weissella、Leuconostoc、OenococcusFructobacillus 這5 個屬為 Lactobacillus 子分支。在過去很長一段時間有廣泛的證據指明這5個屬被認為屬于Lactobacillus,本次分析結果與前人分析結果一致(圖 2)。因此將Lactobacillus、Pediococcus、Weissella、Leuconostoc、Oenococcus和Fructobacillus等6個屬命名為復合的乳桿菌屬(Lactobacillus complex)。結果表明乳桿菌屬為一個并系類群,是由從一個特定的共同祖先不斷進化分化而成,即兼性異型發酵乳桿菌為了適應環境逐漸分化形成嚴格同型和異型發酵乳桿菌。



    圖2:452屬的進化樹:基于16個標記基因的氨基酸序列利用最大似然法構建系統進化樹,不同顏色代表不同的屬。

3、糖苷水解酶在所研究的213個菌株中的分布

  糖苷水解酶glycoside hydrolases(GHs)數據庫共有133個家族,本文中研究的213個菌株共有48個GHs家族(未經驗證)(圖 3)。圖 3左邊縱坐標是菌株名稱,橫坐標是不同的48個GHs家族,右邊縱列不同顏色區域代表了菌株所附著的生物環境,圖中每個菌株對應的GHs家族顏色從黑色到綠色分布,顏色越淺,代表該基因家族在該物種的拷貝數越多。


4、乳桿菌細胞表面互作因子

  我們在213株基因組中共預測1628個LPXTG蛋白,357轉肽酶(sortase)。轉肽酶和LPXTG蛋白在不同菌株中變化非常大(圖4),LPXTG蛋白最多的是分離自牛奶中的Carnobacterium maltaromaticum DSM 20342菌。51株菌中共預測67個PCGs基因簇(圖4),大部分菌株中只有一個PCGs(見補充分析)。L. casei/L. rhamnosus生態多樣性分支中有大量菌毛有差異的菌株。一些菌株中,像L. equicursoris, W. confusa and L. parabuchneri (DSM 15352)僅通過菌毛種類區分各自的分支(圖4c),具體原因目前無法解釋。這項研究中發現50種新的PGCs,有望提供新的途徑在益生菌和其他功能方面。


圖4:不同的LPXTG蛋白編碼基因、轉肽酶、菌毛和細胞膜蛋白酶的豐度


    縱坐標表示基因或者基因簇的數,橫坐標為菌株根據最大似然法的系統進化樹的分布情況

5、CRISPR-Cas系統和可動的遺傳因子

   CRISPR-Cas系統已經在真核和原核生物的基因工程和基因治療中通過精確的目標區域操作得到應用。213株菌分析了62.9%基因組,其中137個CRISPR位點被鑒定。噬菌體序列和質粒序列分別檢測了213株基因組的92%和41%。檢測到的CRISPR序列能夠與目標噬菌體序列和質粒序列匹配(圖5),這與CRISPR-Cas適應系統來源于病毒序列是一致的。



    圖5:比較分析CRISPR序列基于全部的Cas蛋白序列Cas1共線性分析之后構建lactobacilli菌和近緣生物進化樹a;

進化樹b基于Cas9的序列 共線性分析結果;通過Cas9關鍵序列預測的crRNA和tracrRNA序列結果

研究結論:

  從基因組水平首次揭示了乳桿菌屬不同模式菌株間的系統發育關系,并指出乳桿菌屬為一個并系類群,是由從一個特定的共同祖先不斷進化分化而成,即兼性異型發酵乳桿菌為了適應環境逐漸分化形成嚴格同型和異型發酵乳桿菌,提出用于新種分類的新的基因組系統發育框架。通過比較基因組學分析,我們還發現乳桿菌屬編碼大量的碳水化合物水解酶和糖基轉移酶,同時擁有豐富多樣的CRISPR-CAS系統。在適應性進化過程中,伴隨有蛋白水解系統獲得、丟失的現象。

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